Jumat, 14 Oktober 2011

laporan protein (biokimia)

PENDAHULUAN
            Protein berasal dari kata protos yang berarti utama merupakan senyawa organik kompleks yang memiliki bobot molekul tinggi. Protein merupakan polimer yang terdiri dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Penyusun utama protein adalah urutan berulang dari satu atom nitrogen dan dua atom karbon dengan asam amino yang bertautan lewat ikatan peptida. Semua protein baik yang berasal dari bakteri yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari  rangkaian dasar yang sama dari 20 asam amino yang berikatan kovalen dalam urutan yang khas (Hart 2003).
            Protein dapat dihidrolisis sehingga menghasilkan komponen asam amino. Ketika protein dihidrolisis maka asam amino pembangunnya dibebaskan dari ikatan kovalennya yang menghubungkan molekul-molekul ini menjadi rantai. Semua asam amino memiliki ciri yang sama, yaitu memiliki gugus karboksil dan gugus amino yang diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing yang membedakannya ialah rantai samping yang mengikat asam amino atau gugus R yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik dan kelarutan di dalam air. Asam amino dapat digolongkan menjadi 4 golongan berdasarkan gugus R yang mengikat, yaitu: golongan asam amino dengan gugus R nonpolar ( metionin dan triptofan), golongan asam amino dengan gugus R polar tetapi tidak bermuatan (glisin dan tirosin), golongan dengan gugus R bermuatan negatif (aspartat dan glutamat), golongan asam amino dengan gugus R bermuatan positif (lisin) (Lehninger 1982).
Protein bersifat amfoter, yaitu dapat bereaksi dengan larutan asam dan basa. Daya larut protein berbeda di dalam air, asam, dan basa; ada yang mudah larut dan ada yang sukar larut. Namun, semua protein tidak larut dalam pelarut lemak seperti eter dan kloroform. Apabila protein dipanaskan atau ditambah etanol absolut, maka protein akan menggumpal (terkoagulasi). Hal ini disebabkan etanol menarik mantel air yang melingkupi molekul-molekul protein.
Kelarutan protein di dalam suatu cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain, pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya.Protein seperti asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-beda. Titik Isoelektrik (TI) adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol (Poedjiadi 1994).
Denaturasi protein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sejak diketahui reaksi denaturasi tidak cukup kuat untuk memutuskan ikatan peptida, dimana struktur primer protein tetap sama setelah proses denaturasi. Denaturasi terjadi karena adanya gangguan pada struktur sekunder dan tersier protein. Pada struktur protein tersier terdapat empat jenis interaksi yang membentuk ikatan pada rantai samping seperti; ikatan hidrogen, jembatan garam, ikatan disulfida dan interaksi hidrofobik non polar, yang kemungkinan mengalami gangguan. Denaturasi yang umum ditemui adalah proses presipitasi dan koagulasi protein (Ophart 2003).
Denaturasi, koagulasi dan redenaturasi dapat dibedakan sebagai berikut. Denaturasi protein adalah suatu keadaan telah terjadinya perubahan struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul, tanpa menyebabkan pemutusan atau kerusakan lipatan antar asam amino dan struktur primer protein. Koagulasi adalah denaturasi protein akibat panas dan alkohol (Winarno 2002). Redenaturasi adalah denaturasi protein yang berlangsung secara reveresibel (Poedjiadi  1994).

TUJUAN
            Praktikum bertujuan mempelajari beberapa reaksi uji asam amino dan protein protein. Menunjukkan sifat dan struktur asam amino dan protein melalui uji kualitatif. Mengidentifikasi keberadaan asam amino dan protein melalui uji kualitatif.


ALAT DAN BAHAN
            Alat-alat yang digunakan ialah tabung reaksi, rak tabung reaksi, pipet mohr 10 ml, pipet tetes, gelas piala 100 ml dan 200 ml, penangas air, gegep kayu, pembakar gas, kasa asbes, kaki tiga, batang pengaduk, corong kaca, erlemeyer, bulp.
            Bahan-bahan yang digunakan ialah pereaksi Millon, albumin 2% dan 0,02% , gelatin 2% dan 0,02%, kasein 2% dan 0,02%, pepton 2% dan 0,02%, fenol 2% dan 0,02%, ninhidrin 0,1%,          NaOH 10%, Pb-Asetat 5%, HNO3 pekat, CuSO4 0,1%, HgCl2 2%, AgNO3 5%, (NH4)2SO4, pereaksi biuret, asam asetar 1M, HCl 0,1M, NaOH 0,1M, buffer asetat pH 4,7, etanol 95%, aquades.

PROSEDUR KERJA
            Pengujian yang dilakukan terhadap uji protein ialah uji millon, uji ninhidrin, uji belerang, uji xantoproteat, uji biuret, uji pengendapan oleh logam, pengendapan oleh garam, uji koagulasi, pengendapan oleh alkohol dan denaturasi protein. Uji millon dilakukan dengan cara larutan protein (albumin, gelatin, kasein, pepton dan fenol) dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 3 ml. Larutan tersebut ditambahkan dengan 5 tetes pereaksi millon. Campuran dipanaskan dan diamati serta dibandingkan hasil dari masing-masing protein.
            Uji ninhidrin dilakukan dengan menyiapkan 3 ml larutan protein (albumin, gelatin, kasein, pepton, fenol) di dalam tabung reaksi. Masing-masing tabung ditambahkan dengan 10 tetes larutan ninhidrin 0,1%. Larutan tersebut dipanaskan pada air mendidih selama 5 menit dan diperhatikan perubahan warna yang terjadi.
Uji belerang dilkukan dengan menyiapkan tabung reaksi. Tabung reaksi tersebut diisi dengan 2 ml larutan protein (albumin, gelatin, kasein, pepton, fenol). Masing-masing tabung ditambahkan dengan 5 ml NaOH 10%. Campuran dipanaskan selama 3 menit. Larutan tersebut kemudian ditambahkan 2 tetes larutan Pb-asetat 5% dan pemanasan dilanjutkan selama 1 menit. Hasil percobaan diamati dan dibandingkan dengan protein lainnya.
            Uji xantoproteat dilakukan dengan menambahkan 2 tetes HNO3 pekat ke dalam tabung reaksi yang berisi 2 ml larutan protein (albumin, gelatin, pepton, kasein, dan fenol). Campuran tersebut dipanaskan dengan hati-hati hingga terbentuk warna kuning tua. Tabung reaksi yang telah dipanaskan diangkat dan didinginkan. Kemudian masing-masing tabung ditambahkan dengan 5 tetes NaOH pekat hingga larutan menjadi basa. Perubahan yang terjadi pada larutan diamati.
            Uji biuret dilakukan dengan memipet 3 ml larutan protein (albumin, gelatin, pepton, kasein, dan fenol) ke dalam tabung reaksi. Masing-masing tabung kemudian ditambahkan dengan 1 ml NaOH 10%. Tabung reaksi dikocok dan ditambahkan larutan CuSO4 0,1%. Larutan dikocok kembali dan diamati perubahan warna yang terbentuk.
 Uji pengendapan oleh logam dilakukan dengan menyiapkan 3 buah tabung reaksi. Masing-masing tabung diisi dengan 3 ml albumin. Tabung pertama ditambahkan dengan 5 tetes larutan HgCl2 2%, tabung kedua ditambahkan dengan Pb-Asetat 5% dan tabung ketiga ditambahkan dengan 5 tetes AgNO3 5%. Penambahan HgCl2, Pb-Asetat dan AgNO3 dilakukan secara bersamaan. Masing-masing tabung dibandingkan hasil pengamatannya.
            Uji pengendapan oleh garam dilakukan dengan menjenuhkan 10 ml larutan protein. Larutan protein dipipet sebanyak 10 ml ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan (NH4)2SO4 pertetes hingga mencapai titik jenuh. Ketika larutan telah mencapai titik jenuh, akan terbentuk endapan dan endapan tersebut disaring. Filtratnya diuji kelarutannya dengan air dan pereaksi biuret sebanyak 3 tetes. Sedangkan endapannya diuji dengan pereaksi millon.
Uji koagulasi dilakukan dengan menyiapkan 2,5 ml protein ke dalam tabung reaksi. Larutan tersebut kemudian ditambahkan dengan 1 tetes asam asetat 1M. Tabung tersebut kemudian dimasukkan ke dalam gelas piala yang berisi air mendidih selama 5 menit. Setelah dididihkan, akan terbentuk endapan pada larutan tersebut. Endapan yang terbentuk diambil dengan menggunakan batang pengduk. Endapannya dibagi dua, dan diuji kelarutannya dengan air dan diuji dengan 3 tetes pereaksi millon.
            Pengendapan oleh alkohol dilakukan dengan menyiapkan 4 buah tabung reaksi. Masing-masing tabung diisi dengan 2,5 ml larutan albumin. Tabung pertama ditambahkan dengan 0,5 ml HCl 0,1 M. Tabung 2 ditambahkan dengan 0,5 ml (10 tetes) NaOH 0,1M. Tabung ketiga ditambahkan dengan 0,5 ml buffer asetat pH 4,7. Keempat tabung reaksi tersebut kemudian ditambahkan dengan 3 ml etanol 95%. Keempat tabung diamati dan dibandingkan hasil pengamatannya.
Denaturasi protein dilakukan dengan menyipkan 3 buah tabung reaksi. Masing-masing tabung diisi dengan 4,5 ml larutan albumin. Tabung pertama ditambahkan dengan 0,5 ml HCl 0,1M. Tabung kedua ditambahkan dengan 0,5 ml larutan NaOH. Tabung ketiga ditambahkan dengan 0,5 ml buffer asetat pH 4,7. Ketiga tabung reaksi tersebut dipanaskan di dalam air mendidih selama 15 menit pada suhu kamar. Perubahan yang terjadi diamati. Tabung pertama dan kedua ditambahkan dengan 5 ml buffer asetat pH4,7. Hasilnya dibandingkan pada masing-masing tabung.
DATA DAN HASIL PENGAMATAN
Tabel 1 Hasil Uji Millon
Bahan Uji
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna Larutan
Albumin
-
Kuning
Gelatin
-
Kuning Muda
Kasein
-
Tidak Berwarna
Pepton
+
Orange/ jingga dengan cincin
Fenol
-
Tidak Berwarna

Gambar 1 Hasil uji millon pad alarutan protein
Tabel 2  Hasil Uji Ninhidrin
Bahan Uji
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna Larutan
Albumin
+
Biru Keunguan
Gelatin
-
Tidak Berwarna
Kasein
-
Tidak Berwarna
Pepton
+
Biru Keunguan
Fenol
-
Tidak Berwarna

                                    Gambar 2 Hasil uji ninhidrin pada larutan protein
Tabel 3 Hasil Uji Belerang
Bahan Uji
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna Larutan
Albumin
-
Tidak Berwarna
Gelatin
-
Tidak Berwarna
Kasein
-
Tidak Berwarna
Pepton
Fenol
-
-
Tidak Berwarna
Tidak Berwarna

Gambar 3 Hasil uji belerang pada larutan protein
Tabel 4 Hasil Uji Xanthoproteat
Bahan Uji
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna Larutan
Albumin
+
Jingga
Gelatin
+
Jingga
Pepton
+
Jingga
Kasein
-
Tidak Berwarna
Fenol
+
Kuning Jingga

Gambar 4 Hasil pengujian xantoproteat pada larutan protein




Tabel 5 Hasil Uji Biuret
Bahan Uji
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna Larutan
Albumin
+
Larutan Ungu
Gelatin
+
Ungu Bening
Kasein
+
Larutan Ungu
Pepton
+
Larutan Ungu
Fenol
-
Tidak Berwarna

Gambar 5 Uji Biuret pada protein
Tabel 6 Hasil Uji Pengendapan Albumin Oleh Logam Berat
Logam Berat
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna Larutan
HgCl2
2 tetes terdapat ↙ ++
↙ Putih
Pb-Asetat
3 tetes terdapat ↙ +
↙ Putih
AgNO3
1 tetes terdapat ↙ +++
↙ Putih

Gambar 6 Hasil pengujian pengendapan oleh logam

Tabel 7 Uji Pengendapan Oleh Garam

Pengendapan Garam

Uji
                  (+/-)
Perubahan Warna
Kelarutan
+
Putih Menjadi Keruh
Endapan (Millon)
+
Tidak Berwarna Menjadi Kuning
Filtrat (Biuret)
+
Tidak Berwarna Menjadi Kuning

Gambar 7 Hasil pengujian pengendapan oleh garam
Tabel 8 Uji Koagulasi
Uji
                  (+/-)
Perubahan Warna
Kelarutan (air)
      -
-
Endapan (Millon)
     -
-
Filtrat (Biuret)
     +
Biru

Gambar 8 Hasil pengujian koagulasi
Tabel 9 Pengendapan Oleh Alkohol
Tabung
Hasil Pengamatan (+/-)
Perubahan Warna
1
2
-
-
Tidak Terdapat
Tidak Terdapat
3
+
Terdapat ↙ putih (+++)
4
+
putih setelah ditambah 2 ml etanol

Gambar 9 pengendapan protein oleh alkohol
Tabel 10 Denaturasi protein
Tabung
1
2
3
Sebelum
Tidak Berwarna
Tidak Berwarna
Tidak Berwarna
Pemanasan
Tidak Berwarna
Tidak Berwarna
↙ Putih (++++)
Penambahan Buffer
↙ Putih Keruh (++++)
↙ Putih Keruh (++++)
-

PEMBAHASAN
                                                Gelatin                                    Pepton
                               Kasein                                                      Fenol
                                                    Albumin
Gambar 10 struktur molekul larutan uji yang digunakan

Pengujian terhadap protein dan asam amino dilakukan dengan uji Millon, uji ninhidrin, uji belerang, uji xantoproteat, uji biuret, uji pengendapan oleh logam, uji pengendapan oleh garam, uji koagulasi, uji pengendapan oleh alkohol, dan uji denaturasi protein. Uji Millon merupakan uji yang dilakukan untuk menganalisis protein yang mengandung gugus hidroksil fenil yang akan bereaksi dengan pereaksi Millon. Pereaksi Millon berisi larutan merkuri dan ion merkuro dalam asam nitrat dan asam nitrit. Apabila pereaksi ini ditambahkan ke dalam larutan protein yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik, maka akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Tetapi khusus untuk proteosa dan pepton secara langsung akan menghasilkan larutan berwarna merah. Endapan yang terbentuk berupa garam kompleks dari tirosin yang ternitrasi.
Percobaan terhadap uji Millon hanya menghasilkan hasil yang positif terhadap larutan pepton. Berdasarkan teori seharusnya semua larutan yang diuji akan bereaksi dengan pereaksi Millon membentuk warna merah, namun hasil yang didapatkan pada percobaan jauh berbeda. Hal tersebut terjadi mungkin karena dipengagruhi oleh beberapa kesalahan, diantaranya ialah waktu pemanasan yang kurang lama dan konsentrasi dari larutan yang diuji terlalu encer.
            Uji ninhidrin merupakan uji yang umum sifatnya karena dapat digunakan untuk mendeteksi protein yang memiliki sekurang-kurangnya satu gugus karboksil dan gugus amino bebas (asam α-amino). Apabila ninhidrin (triketohidrin) dipanaskan bersama asam amino, maka akan terbentuk kompleks berwarna biru. Kompleks berwarna biru dihasilkan dari reaksi ninhdrin dengan hasil reduksinya, yaitu hidrindantin dan amonia. Asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan jalan mengamati intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi asam amino tersebut. Pada reaksi ini, dilepaskan CO2 dan NH4 sehingga asam amino asam amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang dilepaskan. Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan kompleks yang berbeda warnanya dengan asam amino lainya. Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan amonia yang dilepaskan pada oksidasi asam amino. Warna yang terbentuk pada prolin dan hidroksi prolin adalah kuning.
Gambar 11 reaksi ninhidrin dengan asam amino

Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, albumin dan pepton bereaksi positif terhadap pereaksi ninhidrin. Sedangkan gelatin, kasein dan fenol menunjukkan hasil yang negatif terhadap pereaksi ninhidrin. Hal tersebut terjadi karena albumin dan pepton berdasarkan strukturnya memiliki
            Uji belerang akan bereaksi positif terhadap protein yang mengandung sistein. Belerang yang terdapat dalam asam amino sistein dibebaskan sebagai ion sulfida dengan kehadiran NaOH. Ion sulfida bereaksi dengan Pb2+ dari Pb-asetat membentuk garam PbS yang berupa endapan hitam. Fungsi penambahan NaOH 10% bertujuan untuk memecah ikatan sulfida yang terkandung dalam asam amino, sedangkan fungsi penambahan Pb-asetat ialah untuk mengikat sulfida yang telah diputuskan oleh NaOH membentuk garam PbS yang berwarna hitam. Reaksi yang terjadi ialah Pb2+ + S2-  PbS (hitam)
            Uji belerang yang dilakukan pada percobaan, semua larutan yang diuji tidak menhasilkan hasil yang positif. Hal tersebut dikarenakan larutan  yang digunakan yaitu albumin, gelatin, kasein, pepton, dan fenol tidak mempunyai gugus asam amino yang memiliki gugus belerang, sedangkan uji belerang hanya memberikan hasil positif terhadap protein yang mengandung asam amino yang memiliki gugus belerang tersebut seperti sistein, sistin, dan metionin
            Uji Xantoproteat  merupakan uji kualitatif protein. Uji ini positif untuk protein yang mengandung asam amino dengan inti benzena, misalnya tirosin, triptofan, dan fenilalanin. Pada uji Xantoproteat ini, larutan asam nitrat pekat (HNO3) ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan kemudian menjadi warna jingga bila dibuat alkalis (basa) dengan larutan NaOH. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi atau reaksi substitusi atom H pada benzena yang terdapat pada molekul protein oleh gugus nitro. Inti benzena dapat ternitrasi oleh asam nitrat pekat menghasilkan turunan nitrobenzena.
Gambar 12 Reaksi pada uji Xantopriteat
            Uji Xantoproteat pada percobaan hanya menunjukkan hasil yang negatif pada larutan kasein, sedangkan pada larutan albumin, pepton, gelatin dan fenol menunjukkan hasil yang positif dengan intensitas warna yang berbeda-beda. Hal ini terjadi karena pada larutan albumin, pepton, gelatin dan fenol memiliki inti benzena sehingga dapat mengalami reaksi/proses nitrasi oleh asam nitrat pekat yang ditambahkan.
            Prinsip dari uji biuret ialah pembentukan senyawa kompleks Cu2+ (berasal dari larutan CuSO4) dengan gugus karbonil (-CO) dan gugus amina (-NH) yang berasal dari ikatan peptida dalam suasana basa. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk mencegah terjadinya endapan Cu(OH)2 dan memecah ikatan protein agar terbentuk urea sebgai katalisator untuk mempercepat reaksi. Larutan CuSO4 yang ditambahkan berfungsi sebagai donor Cu2+ yang kemudian akan bereaksi dan membentuk kompleks ungu.
2CO(NH2)2à CONH2 – NH --CONH2 (biuret) + NH3
CuSO4+ 2H2O à Cu(OH)2 + H2SO4
Cu(OH)2 + NH3 à warna ungu
            Berdasarkan percobaan yang dilakukan uji biuret menunjukkan hasil positif terhadap albumin, gelatin, kasein dan pepton. Sedangkan fenol tidak bereaksi dengan pereaksi biuret. Hal ini disebabkan albumin, kasein, pepton dan kasein merupakan asam amino yang memiliki ikatan peptida sehingga dapat bereaksi dengan Cu2+ membentuk kompleks ungu dalam suasana basa. Fenol tidak termasuk ke dalam golongan asam amino sehingga tidak memiliki ikatan peptida dan bereaksi negatif terhadap uji biuret.
Garam logam berat seperti Ag, Pb, dan Hg akan membentuk endapan logam proteinat. Ikatan yang terbentuk amat kuat dan akan memutuskan jembatan garam, sehingga protein mengalami denaturasi. Gugus –COOH dan gugus –NH2 yang terdapat dalam protein dapat bereaksi dengan ion logam berat dan membentuk senyawa kelat. Ion-ion tersebut ialah Ag+, Ca++, Zn++, Hg++, Fe++, Cu++, Co++, Mn++ dan Pb++. Selain gugus –COOH dan gugus –NH2, gugus –R pada molekul asam amino tertentu juga dapat bereaksi dengan ion atau senyawa lain. Gugus sulfihidril (-SH) pada molekul sistein akan bereaksi dengan ion Ag+atau Hg++ (Poedjiadi, 1994).
Garam logam berat umumnya mengandung Hg+2, Pb+2, Ag+ , Tl+, Cd+2 dan logam lainnya dengan berat atom yang besar. Reaksi yang terjadi antara garam logam berat akan mengakibatkan terbentuknya garam protein-logam yang tidak larut atau disebut juga endapan logam proteinat (Ophart 2003). Dasar reaksi dari pengendapan oleh logam berat ialah penetralan muatan. Protein pada dasarnya meemiliki titik isoelektrik yang bermuatan positif dan negatif dengan perbandingan yang sama. Pengendapan protein dapat terjadi bila protein berada dalam bentuk isoelektrik yang bermuatan negatif, dimana muatan positif dari logam berat (Hg+, Ag+, Pb+) mendenaturasi protein tersebut menghasilkan  garam netral proteinat yang mengendap.
Hasil percobaan pada denaturasi protein, tabung 3 (AgNO3) menghasilkan endapan yang paling banyak dibanding  tabung lain, sedangkan tabung 2 (Pb-asetat) menghasilkan endapan yang paling sedikit. Hal tersebut terjadi karena berdasarkan urutan di sistem periodik, logam Ag dan Hg merupakan logam transisi sedangkan logam Pb bukan.
Kelarutan protein akan berkurang jika tedapat garam – garam anorganik dengan konsentrasi tinggi bereaksi dengan protein. Garam netral konsentrasi tinggi yang ditambahkan akan menyebabkan protein mengendap. Peristiwa pemisahan protein tersebut disebut dengan salting out. Proses pengendapan terus terjadi karena kemampuan ion garam tersebut terhidrasi sehingga terjadi kompetisi antara garam anorganik dengan molekul protein untuk mengikat air. Garam anorganik lebih menarik air sehingga jumlah air yang tersedia untuk molekul protein akan berkurang ( Winarno 2002).
            Larutan albumin dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amonium sulfat (NH4)2SO4 jenuh ( Poedjiadi 1994). Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi millon pada endapan berfungsi untuk mengetahui ada atau tudaknya kandungan tirosin sedangkan penambahan pereaksi Biuret pada filtrat berfungsi untuk mengetahui ada atau tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan.
            Berdasarkan percobaan, larutan protein  dijenuhkan dengan penambahan amonium sulfat. Filtrat dari larutan tersebut larut dalam air dan bereaksi positif dengan pereaksi biuret ditandai dengan adanya larutan berwarna violet. Sedangkan endapan yang terbentuk menghasilkan hasil yang positif terhadap pereaksi millon. Pengujian endapan yang dihasilkan dengan pereaksi milon bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya kandungan tirosin, sedangkan pengujian filtrat dengan pereaksi biuret bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya gugus amida pada filtrat yang dihasilkan.
Protein akan mengalami koagulasi jika dipanaskan pada suhu 50oC atau lebih. Proses koagulasi akan terjadi jika larutan protein berada pada titik isoelektriknya. Kelarutan protein akan berkurang pada suhu 50oC karena pada suhu yang tinggi, energi kinetik pada protein akan meningkat sehingga terjadi kerusakan konformasi alamiah protein. Rusaknya konformasi alamiah protein tersebut menyebabkan terganggunya stabilitas dari larutan protein dan larutan protein mengalami koagulasi. Terjadinya koagulasi protein juga disebabkan karena adanya ion H+ dari CH3COOH yang terikat pada gugus negatif dari protein. Ketika ion H+ tersebut masuk ke dalam larutan, ion H+ akan mempengaruhi keseimbangan dan pengkutuban muatan dari molekul protein. Penambahan asam asetat ke dalam larutan albumin berfungsi agar albumin mencapai titk isolistriknya dan proses koagulasi dapat tercapai. Hanya pada filtrat protein dilakukan uji biuret yang menghasilkan warna biru. Sedangkan pada uji kelarutan dalam air dan uji endapan dengan pereaksi millon tidak dilakukan.
Pelarut organik dapat mengubah konstanta dielektrik air sehingga pelarut organik yang bereaksi dengan protein akan menyebabkan kelarutan protein menjadi  berkurang. Penambahan alkohol ke dalam albumin pun dapat mengurangi kelarutan albumin dalam air karena alkohol dan protein akan berkompetisi untuk saling mengikat air, dalam hal ini alkohol yang dapat lebih mengikat air dalam larutan sehingga protein (albumin) akan mengendap. Protein dengan ujung C asam amino yang terbuka dapat bereaksi dengan alkohol dalam suasana asam membentuk senyawa protein ester. Pembentukan ester ini ditunjukkan oleh adanya endapan yang terbentuk.
Penambahan larutan HCl ke dalam tabung 1 menyebabkan larutan albumin menjadi mengendap. Mengendapnya larutan albumin tersebut  disebabkan karena setelah penambahan larutan HCl, pH larutan protein (albumin) berada di bawah titik isoelektrik (rendah), sehingga larutan albumin semakin cepat mengendap karena kelarutannya dalam air sangat berkurang. Ketika ditambahkan dengan etanol, larutan albumin semakin banyak yang mengendap karena gugus –OH dari etanol lebih mudah terhidrasi daripada molekul protein, sehingga kelarutan protein dalam air berkurang.
Pada tabung kedua, penambahan larutan NaOH 0,1 M  ke dalam larutan albumin  menyebabkan pH larutan di atas pH isoelektrik sehingga kelarutan albumin dalam air meningkat dan larutan tetap bening. Ketika ditambahkan dengan etanol, larutan tetap bening karena molekul-molekul protein (albumin) yang kelarutanya telah meningkat akibat penambahan basa tidak kalah bersaing dengan gugus –OH dari etanol untuk mengikat air, sehingga molekul protein tidak mengendap dan larutan tetap bening.
Pengujian pada tabung 3, larutan albumin yang ditambahkan dengan buffer asetat pH 7 menyebabkan larutan albumin menjadi mengendap. Hal ini terjadi karena kondisi larutan berada di bawah pH isoelektrik dan pH larutan buffer asetat yang sedikit asam. Pada kondisi ini kelarutan albumin berada pada titik minimum dan albumin akan mengendap. Dengan penambahan alkohol (etanol 95%) menyebabkan protein semakin banyak yang mengendap  karena molekul protein kalah bersaing dengan gugus –OH dari etanol untuk mengikat air, sehingga molekul protein akan mengendap.
Gambar Denanturasi protein

Denaturasi protein merupakan perubahan terhadap struktur sekunder, tersier, dan kuartener molekul protein tanpa terjadinya pemecahan ikatan-ikatan kovalen. Denaturasi terjadi karena terpecahnya ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, ikatan garam dan terbukanya lipatan molekul protein. Denaturasi, koagulasi dan redenaturasi dapat dibedakan sebagai berikut. Denaturasi protein adalah suatu keadaan telah terjadinya perubahan struktur protein yang mencakup perubahan bentuk dan lipatan molekul, tanpa menyebabkan pemutusan atau kerusakan lipatan antar asamamino dan struktur primer protein. Koagulasi adalah denaturasi protein akibat panas dan alkohol.
Pada percobaan denaturasi protein dibuat tiga larutan protein, dimana pada masing-masing larutan protein tersebut ditambahkan dengan senyawa yang berbeda. Tabung 1 berisi albumin yang ditambahkan dengan larutan HCl 0,1 M yang kemudian dipanaskan, tidak terjadi perubahan pada larutan albumin tersebut. Hal ini terjadi karena penambahan HCl yang bersifat sebagai asam kuat menyebabkan pH larutan protein menjadi sangat asam. Tabung 2 berisi albumin yang ditambahkan dengan NaOH 0,1 N kemudian dipanaskan, tidak menyebabkan perubahan pada larutan protein. Hal ini disebabkan karena larutan NaOH bersifat sebagai basa kuat, sehingga terjadi perubahan pH yang sangat extrem pada larutan protein menjadi basa.
Tabung 3 berisi albumin yang ditambahkan dengan buffer asetat kemudian dipanaskan, menyebabkan timbulnya endapan putih. Endapan putih yang terbentuk mengindikasikan terjadinya denaturasi protein. Denaturasi ini disebabkan karena buffer asetat sangat kuat mempertahankan pHnya pada pH 4,7 sehingga dapat merusak keseimbangan switer ion ke kondisi asam di bawah titik isoelektrik. Perubahan struktur yang diakibatkan proses denaturasi adalah perubahan konfigurasi protein α-heliks menjadi memanjang. Hal ini disebabkan karena rusaknya ikatan hidrogen dan ikatan nonpolar yang terjadi pada struktur berlipat dari protein. Tabung 1 dan 2 yang kemudian ditambahkan dengan larutan buffer asetat pH 4,7 mengalami pembentukkan endapan. Hal tersebut terjadi seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, yaitu terjadi denaturasi preotein karena buffer asetat sangat kuat mempertahankan pHnya pada pH 4,7.
           
SIMPULAN
            Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa pada uji Millon larutan albumin, gelatin, kasein dan fenol menunjukkan hasil yang negatif. Larutan pepton menghasilkan reaksi positif terhadap uji millon dengan adanya warna kuning. Uji ninhidrin menunjukkan hasil yang positif terhadap larutan albumin dan pepton. Sedangkan larutan kasein, gelatin dan fenol menunjukkan hasil yang negatif. Uji belerang yang dilakukan semua larutan protein menunjukkan hasil yang negatif. Uji xantoproteat menunjukkan hasil yang positif terhadap albumin, gelatin, pepton dan fenol. Sedangkan larutan kasein bereaksi negatif terhadap pereaksi xantoproteat. Uji biuret menunjukkan hasil positif terhadap larutan albumin, gelatin, kassein dan pepton. Fenol menunjukkan hasil yang negatif terhadap pereaksi biuret.
            Penentuan terhadap pengendapan diperoleh hasil bahwa AgNo3 menghasilkan endapan yang paling banyak hanya dengan penambahan 1 tetes larutan, Sedangkan HgCl menghasilkan endapan yang lebih banyak daripada Pb-asetat.  Uji koagulasi menunjukkan hasil positif terhadap kelarutan dengan air, pereaksi millon dan pereaksi biuret. Uji koagulasi menghasilkan hasil yang positif terhadap uji biuret. Tabung 1 (albumin+HCl) dan tabung 2 (albumin+NaOH+etanol 95%) menunjukkan hasil negatif terhadap uji pengendapan oleh alkohol sedangkan hasil yang positif (mengendap) ditunjukkan pada tabung reaksi berisi albumin+buffer-asetat+etanol (tabung 3) dan tabung 4 yaitu blanko. Campuran albumin + HCl dan albumin + NaOH bereaksi negatif pada pengujian denaturasi pretein dan mengendap setelah penambahan buffer-asetat. Sebaliknya campuran albumin + buffer asetat mengalami kekeruhan namun menjadi jernih saat penambahan buffer-asetat yang berlebihan.

DAFTAR PUSTAKA
Ophart, C.E., 2003. Virtual Chembook. Elmhurst College.
Hart H, Craine L E, Hart D J. 2003. Kimia Organik. Suminar S A; penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry.         
Lehninger A L. 1982. Dasar- Dasar Biokimia. Maggy T; penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principle of Biochemistry.
Poedjiiadi A. 1994. Dasar – Dasar Biokimia. Jakarta:UI-Press
Winarno FG. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia:Jakarta.



Tidak ada komentar:

Poskan Komentar